黑线姬鼠体型比小家鼠稍大。头长、耳较短，向前折一般达不到眼部。背部正中有一显著黑色纵纹，从两耳之间一直延伸至接近尾的基部。尾稍短于体长。背部其它毛为棕褐色，腹毛灰白色。
黑线姬鼠喜欢栖息于向阳、潮湿、近水处。夏季多栖息于稻田埂、坟地及溪流旁，冬季常藏匿于草滩及柴草垛中，有时也进入阴沟和住宅区内。洞穴构造较简单，有2—5个洞口。
黑线姬鼠不冬眠。大多在夜晚活动，以清晨和黄昏为甚。每年以春秋两季活动较为活跃。可随自然条件和食物来源迁移。一年繁殖3—6胎，每胎产4一8仔。
黑线姬鼠食性很杂，主要吃植物种籽、叶、茎、根等，对水稻、麦类、豆类、高粱、花生、番薯等农作物的危害严重，并危害瓜果和树苗。它是流行性出血热的主要传染源，对人类危害极大。